2× mistura mestra azul do verde QPCR do universal GSK com amortecedor amarelo da diluição do molde 40×

do qPCR azul do verde de 2×Universal mistura mestra GSK com amortecedor da diluição do molde 40×Yellow

Introdução do qPCR azul do verde de 2×Universal da mistura mestra GSK:

Este produto é uma solução do premix 2x para o qPCR usando o método quiméricoe da fluorescência do verde I de GSK. O componente do núcleo, polimerase de ADN de Taq, é uma polimerase de ADN calor-ativada obstruída pelo método do anticorpo, que pode eficazmente inibir a amplificação não específica sob circunstâncias de baixa temperatura. Entrementes, combinado com o amortecedor da reação aperfeiçoou para o qPCR, a polimerase de ADN de Taq é muito apropriada para a reação alta do qPCR da especificidade e da sensibilidade. Uma boa curva padrão pode ser obtida em uma área quantitativa larga, que seja exata, reprodutível e segura para a análise quantitativa de genes do alvo. Ao mesmo tempo, este produto contém uma tintura passiva especial da referência de ROX que seja apropriada para o uso em todos os instrumentos do qPCR, e não há nenhuma necessidade de ajustar a concentração de ROX em instrumentos diferentes. A tintura azul é adicionada no premix, que tem o efeito do projétil luminoso de adicionar amostras, e o diluente amarelo do molde é fornecido ao mesmo tempo. Quando o molde for diluído com o diluente amarelo do molde e adicionou no premix azul da reação, as mudanças da cor do azul ao verde, que pode jogar um papel do projétil luminoso na preparação do processo do sistema de reação e impedir o escapamento ou o misaddition. Os espectros das tinturas azuis e amarelas não sobrepõem com as tinturas do qPCR e não afetam os resultados da reação.

Informações sobre o produto do qPCR azul do verde de 2×Universal da mistura mestra GSK:

Condições do armazenamento e de manipulação com mistura mestra verde azul do qPCR 2×Universal com amortecedor da diluição do molde 40×Yellow:

Transporte molhado do saco de gelo; Armazenado na temperatura de -20℃, válida por 12 meses.

Protocolo/procedimentos do ensaio:

1. Diluição (opcional) do molde do qPCR azul do verde de 2×Universal da mistura mestra GSK:

Este jogo fornece um amortecedor AMARELO da diluição do molde 40x, uma diluição amarela diluída 40 dobras do molde que possa ser usada para determinar exatamente se o molde esteve adicionado ao líquido da reação do qPCR mudando a cor do líquido. Tomar o sistema de reação do qPCR 20ul como um exemplo, de acordo com a quantidade do molde da diluição adicionou na solução da reação do qPCR 20ul, o método correspondente da diluição do molde original pode ser referida a seguinte tabela (que toma o molde original diluído a 100ul como um exemplo):

Exemplo:

2ul diluiu o molde deve ser adicionado ao sistema de reação do qPCR 20ul.

Tomando o sistema da diluição do molde 100ul como um exemplo, quando o volume original do molde é 20ul, o amortecedor amarelo da diluição do molde de 25ul 40x é adicionado, e a água Nuclease-livre 55ul é adicionada então ao volume total de 100ul.

O AMORTECEDOR AMARELO da DILUIÇÃO do MOLDE 40x é agora 10x. Adicione 2ul do molde diluído em um amortecedor da diluição da diluição 20ul, e o amortecedor final da diluição do molde do AMARELO 40× é 1x. Em conclusão, o amortecedor amarelo da diluição do molde deve ser 1x no sistema final do qPCR.

Nota: Se o molde não precisa de ser diluído, ou se o diluente do molde de G3362-2 não está usado, você pode ignorar esta etapa.

2. Recomende o sistema de reação do qPCR sobre do qPCR azul do verde de 2×Universal a mistura mestra GSK::

a. Geralmente, um bom efeito da amplificação pode ser obtido com a concentração final de 0.2um. Quando o desempenho da reação é pobre, a concentração da primeira demão pode ser ajustada na escala de 0.2-1.0um.

b. A quantidade de adição do molde varia com o número de cópia do gene do alvo na solução do molde, e a quantidade apropriada de adição do molde é discutida pela diluição do inclinação. A melhor quantidade da adição de ADN do molde no sistema de reação 20ul era menos de 100 ng. Quando o cDNA (solução da reação do RT) da reação de RT-PCR foi usado como o molde, a quantidade da adição não deve exceder 10% do volume total de solução da reação do PCR.

3. Procedimento da reação do PCR (pode ser ajustado de acordo com os instrumentos):

a: Se a especificidade da amplificação precisa de ser melhorada, a temperatura do procedimento de pas-de-deux ou do recozimento pode ser usada; Para melhorar a eficiência da amplificação, um procedimento da três-etapa ou uma estadia da extensão podem ser usados.

Nota:

1. Vista por favor luvas descartáveis durante a operação para evitar a contaminação do RNase.

2. Os produtos reversos da transcrição podem ser armazenados em -20℃ por um curto período de tempo. Se o armazenamento a longo prazo é necessário, recomenda-se armazená-los em -80℃ após a embalagem para evitar ciclos repetidos da gelo-aproximação amigável.

3. Se o molde é da origem eucariótica, recomenda-se selecionar (descolamento) 18 oligo primeira demão e emparelhá-los com o 3' poli uma cauda do mRNA eucariótica para obter o rendimento o mais alto do cDNA completo.

4. Para a transcrição reversa do RNA prokaryotic, a primeira demão ou Gene Specific Primer aleatório de Hexamer devem ser usados.

5. A primeira demão aleatória de Hexamer tem a aplicabilidade larga e é apropriada para o mRNA, o rRNA, o tRNA, o RNA pequeno e os moldes do lncRNA.

6. Se a transcrição reversa é seguida pelo ensaio do qPCR, (descolamento) a primeira demão 18 oligo e a primeira demão aleatória de Hexamer podem ser misturadas para fazer a eficiência da síntese do cDNA em todas as regiões de mRNA o mesmo, que ajuda a melhorar a autenticidade e a repetibilidade de resultados quantitativos.

7. Se as primeiras demão subsequentes do qPCR são projetadas através dos exons, a etapa da remoção do genoma pode ser omitida.

Princípios de projeto da primeira demão:

1. O comprimento do produto da amplificação é recomendado estar entre 80-300 bp;

2. Comprimento da primeira demão: 18-25 bp;

3. O índice da base G+C nas primeiras demão deve estar entre 40%-60%;

4. A diferença do valor do TM entre primeiras demão dianteiras e primeiras demão reversas é menos do que 2℃, e o valor do TM entre 58-62℃ é o melhor;

5. Aleatoriedade da distribuição baixa;

6. As primeiras demão não devem conter sequências auto-complementares, se não formarão uma estrutura secundária do gancho de cabelo;

7. Deve haver não mais de 4 complementares ou bases homólogos entre duas primeiras demão, se não o dímero da primeira demão será formado, sobreposição especialmente complementar no 3' extremidade;

8. O 3' base terminal da primeira demão são sugeridos para ser G ou C;

9. Nenhum outro produto não específico foi encontrado em resultados da comparação de NCBI.

Problemas comuns e soluções:

Se você precisa mais informação sobre do qPCR azul do verde de 2×Universal a mistura mestra GSK com amortecedor da diluição do molde 40×Yellow, deixe-nos por favor saber em linha, obrigado.