|
Detalhes do produto:
|
| Nome de produtos: | qPCR | Temperatura de armazenamento: | – °C 20 |
|---|---|---|---|
| Robusto e ativo para a síntese do cDNA: | até 55°C. | Aplicação: | PCR |
| Volume: | 1ml | Transcrição reversa: | variação da temperatura (42-60°C) |
| Realçar: | Multiplex universal QPCR de TaqMan,Reagente bioquímico do multiplex QPCR de TaqMan,multiplex QPCR de 1ml TaqMan |
||
Mistura mestra do qPCR universal do multiplex de TaqMan
Princípios de projeto da primeira demão:
1. O comprimento do produto da amplificação é recomendado estar entre 80-300 bp;
2. Comprimento da primeira demão: 18-25 bp;
3. O índice da base G+C nas primeiras demão deve estar entre 40%-60%;
4. A diferença do valor do TM entre primeiras demão dianteiras e primeiras demão reversas é menos do que 2℃, e o valor do TM entre 58-62℃ é o melhor;
5. Aleatoriedade da distribuição baixa;
6. As primeiras demão não devem conter sequências auto-complementares, se não formarão uma estrutura secundária do gancho de cabelo;
7. Deve haver não mais de 4 complementares ou bases homólogos entre duas primeiras demão, se não o dímero da primeira demão será formado, sobreposição especialmente complementar no 3' extremidade;
8. O 3' base terminal da primeira demão são sugeridos para ser G ou C;
9. Nenhum outro produto não específico foi encontrado em resultados da comparação de NCBI.
Introdução da mistura mestra do qPCR universal do multiplex de TaqMan:
Este produto é uma solução do premix 2x para o qPCR usando o método quiméricoe da fluorescência do verde I de GSK. O componente do núcleo, polimerase de ADN de Taq, é uma polimerase de ADN calor-ativada obstruída pelo método do anticorpo, que pode eficazmente inibir a amplificação não específica sob circunstâncias de baixa temperatura. Entrementes, combinado com o amortecedor da reação aperfeiçoou para o qPCR, a polimerase de ADN de Taq é muito apropriada para a reação alta do qPCR da especificidade e da sensibilidade. Uma boa curva padrão pode ser obtida em uma área quantitativa larga, que seja exata, reprodutível e segura para a análise quantitativa de genes do alvo. Ao mesmo tempo, este produto contém uma tintura passiva especial da referência de ROX que seja apropriada para o uso em todos os instrumentos do qPCR, e não há nenhuma necessidade de ajustar a concentração de ROX em instrumentos diferentes. A tintura azul é adicionada no premix, que tem o efeito do projétil luminoso de adicionar amostras, e o diluente amarelo do molde é fornecido ao mesmo tempo. Quando o molde for diluído com o diluente amarelo do molde e adicionou no premix azul da reação, as mudanças da cor do azul ao verde, que pode jogar um papel do projétil luminoso na preparação do processo do sistema de reação e impedir o escapamento ou o misaddition. Os espectros das tinturas azuis e amarelas não sobrepõem com as tinturas do qPCR e não afetam os resultados da reação.
Protocolo/procedimentos do ensaio sobre a mistura mestra do qPCR universal do multiplex de TaqMan:
1. Diluição (opcional) do molde:
Este jogo fornece um amortecedor AMARELO da diluição do molde 40x, uma diluição amarela diluída 40 dobras do molde que possa ser usada para determinar exatamente se o molde esteve adicionado ao líquido da reação do qPCR mudando a cor do líquido. Tomar o sistema de reação do qPCR 20ul como um exemplo, de acordo com a quantidade do molde da diluição adicionou na solução da reação do qPCR 20ul, o método correspondente da diluição do molde original pode ser referida a seguinte tabela (que toma o molde original diluído a 100ul como um exemplo):
| Adicione o molde diluído à solução da reação do qPCR 20ul (o ul) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Adicione o amortecedor da diluição do molde do AMARELO 40x ao sistema da diluição do molde 100ul (o ul) | 50 | 25 | 16,7 | 12,5 | 10 | 8,4 | 7,2 | 6,3 |
| Adicione o sistema da diluição do molde 100ul ao molde preliminar (o ul) | x | x | x | x | x | x | x | x |
| volume de adicionar a nuclease - água livre (ul) | 50-x | 75-x | 83.3-x | 87.5-x | 90-x | 91.6-x | 92.8-x | 93.7-x |
Exemplo:
2ul diluiu o molde deve ser adicionado ao sistema de reação do qPCR 20ul.
Tomando o sistema da diluição do molde 100ul como um exemplo, quando o volume original do molde é 20ul, o amortecedor amarelo da diluição do molde de 25ul 40x é adicionado, e a água Nuclease-livre 55ul é adicionada então ao volume total de 100ul.
O AMORTECEDOR AMARELO da DILUIÇÃO do MOLDE 40x é agora 10x. Adicione 2ul do molde diluído em um amortecedor da diluição da diluição 20ul, e o amortecedor final da diluição do molde do AMARELO 40× é 1x. Em conclusão, o amortecedor amarelo da diluição do molde deve ser 1x no sistema final do qPCR.
Informações sobre o produto da mistura mestra do qPCR universal do multiplex de TaqMan:
| Nome do produto | Identificação do produto | Modelo |
| Mistura mestra do qPCR universal do multiplex de TaqMan | GS-MBP0044-01 | 1ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 mL | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 mL |
Condições do armazenamento e de manipulação com mistura mestra do qPCR universal do multiplex de TaqMan:
Transporte molhado do saco de gelo; Armazenado na temperatura de -20℃, válida por 12 meses.
Nota: Se o molde não precisa de ser diluído, ou se o diluente do molde de G3362-2 não está usado, você pode ignorar esta etapa.
2. procedimento da reação do PCR (pode ser ajustado de acordo com os instrumentos):
a: Se a especificidade da amplificação precisa de ser melhorada, a temperatura do procedimento de pas-de-deux ou do recozimento pode ser usada; Para melhorar a eficiência da amplificação, um procedimento da três-etapa ou uma estadia da extensão podem ser usados.
Nota:
1. Vista por favor luvas descartáveis durante a operação para evitar a contaminação do RNase.
2. Os produtos reversos da transcrição podem ser armazenados em -20℃ por um curto período de tempo. Se o armazenamento a longo prazo é necessário, recomenda-se armazená-los em -80℃ após a embalagem para evitar ciclos repetidos da gelo-aproximação amigável.
3. Se o molde é da origem eucariótica, recomenda-se selecionar (descolamento) 18 oligo primeira demão e emparelhá-los com o 3' poli uma cauda do mRNA eucariótica para obter o rendimento o mais alto do cDNA completo.
4. Para a transcrição reversa do RNA prokaryotic, a primeira demão ou Gene Specific Primer aleatório de Hexamer devem ser usados.
5. A primeira demão aleatória de Hexamer tem a aplicabilidade larga e é apropriada para o mRNA, o rRNA, o tRNA, o RNA pequeno e os moldes do lncRNA.
6. Se a transcrição reversa é seguida pelo ensaio do qPCR, (descolamento) a primeira demão 18 oligo e a primeira demão aleatória de Hexamer podem ser misturadas para fazer a eficiência da síntese do cDNA em todas as regiões de mRNA o mesmo, que ajuda a melhorar a autenticidade e a repetibilidade de resultados quantitativos.
7. Se as primeiras demão subsequentes do qPCR são projetadas através dos exons, a etapa da remoção do genoma pode ser omitida.
Problemas comuns e soluções:
| Descrição de problema | Razões possíveis | Soluções |
| No fim da reação, nenhuma curva da amplificação apareceu ou o valor do CT apareceu demasiado tarde | A concentração do molde é demasiado baixa | Repita a experiência para reduzir o múltiplo da diluição do molde, e o começo da concentração a mais alta quando a concentração da amostra é desconhecida |
| Degradação do molde | O molde foi preparado outra vez e a experiência foi repetida | |
| Há inibidores do PCR no sistema | Geralmente, o molde é levado dentro, a relação da diluição do molde é aumentada ou o molde com pureza alta reprepared e é repetido | |
| As primeiras demão podem degradar | As primeiras demão que não têm sido usadas por muito tempo devem primeiramente ser testadas para a integridade pela eletroforese da PÁGINA para ordenar para fora a possibilidade de degradação | |
| Baixa eficiência da amplificação | o ncrease a concentração da primeira demão, tenta um procedimento da amplificação da três-etapa, ou remodela a primeira demão | |
| O produto da amplificação é demasiado longo | O comprimento do produto da amplificação foi controlado na escala de 80-300 bp | |
| O controle vazio mostra o sinal | Poluição do sistema de reação | Em primeiro lugar, a água do controle vazio deve ser substituída. Se a mesma situação ainda ocorre, as primeiras demão, os aspiradores e os tubos do PCR devem ser substituídos ou uma mistura mestra nova deve ser começada. O sistema de reação é preparado em uma tabela limpa super para reduzir a poluição do aerossol |
| A amplificação não específica tal como dímero da primeira demão aparece |
Geralmente, é normal para os produtos da amplificação aparecer no controle vazio após 35 ciclos, que devem ser analisadas com a curva de derretimento. Remodele a primeira demão, ajuste a concentração da primeira demão ou para aperfeiçoar o procedimento da reação do PCR |
|
| A curva de derretimento tem picos múltiplos | O projeto da primeira demão é pobre | A primeira demão nova foi remodelada de acordo com os princípios de projeto da primeira demão |
| A concentração da primeira demão é demasiado alta | Reduza a concentração da primeira demão apropriadamente | |
| Há uma contaminação genomic no molde do cDNA | A solução extraída do RNA é digerida usando enzimas do ADN, tais como DSDNase, para remover a contaminação genomic, ou para projetar primeiras demão do transintron | |
| Reprodutibilidade pobre das experiências | O erro de adicionar a amostra é grande |
O uso da pipeta exata, com a pipeta exata da cabeça de alta qualidade da sução; Molde alto da diluição, adicionando o molde de grande volume para reduzir o erro de amostra; O volume da reação de qPCR foi ampliado |
| A concentração do molde é demasiado baixa | Repita a experiência para reduzir os tempos da diluição do molde | |
| Desvio da temperatura em lugar diferentes do instrumento do qPCR | Calibre o instrumento do qPCR regularmente | |
| A curva da amplificação não é lisa | O sinal da fluorescência é demasiado fraco, produzido após a correção do sistema |
Assegure-se de que as tinturas premixed na mistura mestra não estejam degradadas; Substitua o sinal fluorescente recolher melhor materiais de consumo do qPCR |
| Rupturas ou deslizamentos da curva da amplificação | A concentração do molde era mais alta e o valor do valor-limite da linha de base era maior do que o valor do CT | O valor-limite da linha de base (valor -3 do Ct) foi reduzido e os dados reanalyzed |
| As curvas da amplificação de Wells individual deixaram cair de repente agudamente | Há umas bolhas no tubo da reação |
Assegure-se de que a MISTURA esteja dissolvida completamente, e não se rode e não se oscile uniformemente; Depois que a amostra é adicionada, as bolhas estão removidas pela centrifugação com o elástico claro. O momento da pre-desnaturação foi estendido ao minuto 10 de remover as bolhas |
Se você precisa mais informação sobre a mistura mestra do qPCR universal do multiplex de TaqMan, deixe-nos por favor saber em linha, obrigado.
Pessoa de Contato: Ms Kris
Telefone: +8613049739311
